La tecnología CRISPR activada por luz edita genes con mayor precisión y rapidez que los métodos químicos más estándar, y permite la reparación de ADN «súper rápido», según una investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins.
El proceso, llamado CRISPR muy rápido (vfCRISPR), funciona enjaulando el ARN guía con nucleótidos de timina sensibles a la luz, lo que permite que la enzima Cas9 se una al ADN objetivo, pero no lo corte. Cuando los nucleótidos enjaulados se eliminaron por exposición a una frecuencia específica de luz, se produjo la escisión en el sitio de unión.
El equipo, dirigido por Taekjip Ha, Ph.D., profesor de biofísica e ingeniería biomédica, y Bin Wu, Ph.D., profesor asistente de biofísica y química biofísica, insertó el complejo CRISPR / Cas9 en cultivos de células de riñón embrionario humano, y células de cáncer de hueso. Doce horas después iluminaron las células, activando así el ARN guía. Dentro de los 30 segundos de la activación, el complejo CRISPR escindió más del 50% de sus objetivos.
La actividad fuera del objetivo se redujo significativamente de los métodos CRISPR tradicionales, que generalmente usan productos químicos o radiación ionizante. Ninguno de esos métodos es específico de las ubicaciones genómicas, señalaron los investigadores en un artículo en Science.
Ha y Wu demostraron que podían activar el corte CRISPR de roturas de doble cadena en segmentos de ADN tan pequeños como un solo gen. En el futuro, esto puede permitir a los médicos tratar afecciones desencadenadas por un solo gen anormal, como la enfermedad de Huntington. El equipo ha presentado una patente provisional sobre esta tecnología CRISPR.
Los investigadores atribuyeron la cinética más rápida de su enfoque vfCRISPR a la «omisión de la localización nuclear o los pasos de búsqueda de objetivos», escribieron en Science. La eficiencia de escisión, dijeron, se mejoró mediante el uso de Cas9 de tipo salvaje.
«La ventaja de nuestra técnica es que los investigadores pueden hacer que la maquinaria CRISPR encuentre su objetivo sin cortar prematuramente el gen, reteniendo su acción hasta que se exponga a la luz», explicó Roger Zou, M.D.- and Ph.D, Johns Hopkins. Una declaración, «Esto permite a los investigadores tener mucho más control sobre exactamente dónde y cuándo se corta el ADN».
Si bien esta investigación es importante para la edición de genes, también será valiosa para los estudios de reparación de ADN. Después de la escisión, los investigadores observaron el proceso de reparación bajo un microscopio. Determinaron que las proteínas de reparación de ADN comenzaron su trabajo a los dos minutos de la activación CRISPR. Las reparaciones se completaron tan pronto como 15 minutos después. Esto significa que los investigadores pueden ver la actividad en tiempo real y hacer correlaciones.
Para los investigadores, la precisión y velocidad de vfCRISPR significa que la edición de genes puede realizarse en el laboratorio a pedido. Eso permite los estudios en tiempo real de la reparación del ADN, lo que amplía la comprensión de la actividad del ADN que causa el envejecimiento y muchos tipos de cáncer.
Cuando CRISPR / Cas9 se introdujo inicialmente como una herramienta de edición de genes en 2013, se anunció como «uno de los avances científicos más significativos de los últimos años». Prometió una alternativa revolucionaria a herramientas de edición de genes como dedos de zinc o, más recientemente, a nuevas herramientas como NgAgo.
CRISPR funciona utilizando ARN como guía para unirse a una secuencia específica de ADN genómico dentro de una célula. Entonces, la enzima Cas9 dentro de la molécula CRISPR actúa como un escalpelo para cortar esa secuencia de ADN específica. Las propias enzimas y proteínas de la célula reparan la posición del corte. En este punto, se pueden unir otros genes para alterar o reparar las funciones genéticas para afecciones genéticas.
En retrospectiva, CRISPR fue una tecnología innovadora, pero apenas perfecta para la edición de genes. Por ejemplo, como señalan los investigadores, la escisión lleva tiempo y rara vez es sincrónica. Los investigadores también han señalado otros desafíos. Hasta el 20% de las instancias de edición CRISPR dieron como resultado eliminaciones mayores de 250nt, significativamente mayores que las eliminaciones normales de menos de 50nt indels. Algunos se extendieron a varias kilobases desde el sitio de destino.
La tecnología CRISPR inducida por la luz ha estado en la mente de los investigadores durante años. En 2015, los científicos de la Universidad de Duke publicaron los resultados de su trabajo utilizando un sistema CRISPR / Cas9 inducible por la luz para controlar la activación de genes endógenos. Un año después, los investigadores del MIT, en colaboración con colegas del The Broad Institute y del Hospital Brigham and Women, publicaron una estrategia para guiar el ARN de la foto en jaula. En 2018, los científicos de la Universidad del Océano de Shanghai utilizaron CRISPR inducido por la luz para el control espacio-temporal de la expresión del gen del pez cebra.
La investigación y las aplicaciones en CRISPR inducido por la luz continuarán aumentando. La razón es simple: vfCRISPR resuelve muchos de los problemas de la tecnología original al brindar la velocidad y precisión necesarias para la edición de genes y, por lo tanto, avanzar en una amplia gama de investigaciones genómicas.
Gail Dutton
Fuente: https://www.biospace.com/article/-vfcrispr-uses-light-to-bring-precision-and-speed-to-gene-editing/
