Técnicas que permiten manipular el genoma de parásitos causantes de enfermedades –para inhibir la expresión de proteínas e investigar su función, por ejemplo– han venido siendo vastamente empleadas por los científicos en busca de detectar blancos para el desarrollo de fármacos.
Mientras que se han logrado avances en el estudio del Trypanosoma brucei (causante de la enfermedad del sueño) o del Toxoplasma gondii (causante de la toxoplasmosis), por ejemplo, en el caso del Trypanosoma cruzi (causante de la enfermedad de Chagas) los métodos tradicionalmente utilizados para bloquear genes o marcar proteínas intracelulares se han venido mostrando ineficaces.
Con apoyo de la FAPESP, en el marco del Proyecto Temático intitulado “Señalización por iones de calcio en tripanosomátidos”, un grupo coordinado por el profesor Roberto Docampo en la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Campinas (FCM-Unicamp), en São Paulo, Brasil, demostró que es posible manipular el genoma del T. cruzi a través del denominado sistema CRISPR-Cas9 (del inglés clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated gene 9).
Docampo es docente de la Universidad de Georgia, en Estados Unidos, y mantiene una colaboración con el profesor de la Unicamp Aníbal Vercesi desde hace más de 25 años, cuando descubrieron en el T. cruzi un nuevo orgánulo llamado acidocalcisoma, que toma parte en la regulación de los niveles de calcio dentro de la célula. El investigador coordina el Proyecto Temático en el marco del Programa São Paulo Excellence Chair (SPEC), desarrollado en el laboratorio de Vercesi en la Unicamp.
La metodología CRISPR-Cas9 consiste en transfectar (es decir, en introducir intencionalmente ácido nucleicos en las células) el parásito con un vector –en este caso, una pequeña molécula circular de ADN llamada plásmido– de manera tal de inducir la expresión de otras dos moléculas: la enzima Cas9 y el sgARN, que se unirán en el núcleo celular para formar una ribonucleoproteína. La Cas9 es una endonucleasa, es decir, una proteína capaz de producir una rotura en la doble cadena de ADN. El sgARN es una especie de ARN guía, que sirve para conducir a esa enzima hacia el gen blanco. De esta forma, es posible introducir o suprimir material genético en el lugar donde se rompió el ADN. Además del plásmido, también se transfecta una molécula de ADN donante que permite la reparación de la doble cadena.
“Ese proceso se describió inicialmente como un sistema inmunológico rudimentario de bacterias, y posteriormente se lo adaptó para la edición del genoma en organismos eucariontes. Actualmente es posible utilizarlo prácticamente en cualquier tipo de organismo”, comentó Noelia Lander, posdoctoranda de la FCM-Unicamp.
En una investigación dada a conocer en la revista mBio en 2015, el grupo de la Unicamp demostró por primera vez que es posible usar el sistema CRISPR-Cas9 para bloquear genes del T. cruzi.
Más recientemente, en un artículo publicado en The Journal of Biological Chemistry (JBC), el equipo validó el método también para la marcación de proteínas, un proceso que permite establecer su localización en el interior de las células y detectar vías de señalización importantes para la supervivencia del parásito.
“Hicimos lo que se denomina marcación C-terminal de proteínas, que consiste en añadir a la cadena polipeptídica una pequeña molécula, tal como la hemaglutinina (HA), contra la cual ya existen anticuerpos comerciales específicos. Los anticuerpos reconocen a la molécula, se unen a ésta y, mediante microscopía de fluorescencia, es posible ubicar a la proteína que estamos estudiando en la célula”, explicó Lander.
Inicialmente, para confirmar si la técnica funcionaba efectivamente con el T. cruzi, el grupo utilizó el sistema CRISPR-Cas9 para marcar la proteína TcVP1 (pirofosfatasa vacuolar de protones), cuya localización ya se conocía.
“La misma se encuentra presente en el acidocalcisoma. Ya existen anticuerpos específicos contra esa proteína TcVP1 que apuntaron la misma localización que se observó cuando empleamos el método CRISPR-Cas9”, comentó Lander.
Posteriormente, el sistema CRISPR-Cas9 se empleó para marcar y localizar tres otras proteínas: la TcFCaBP (proteína flagelar de unión al calcio), hallada en el flagelo del parásito, la TcMCU (uniporter de calcio mitocondrial), que fue detectada en la mitocondria, y la TcIP3R (receptor de inositol trifosfato), cuya localización se confirmó en el acidocalcisoma.
“En relación a la TcIP3R, existía una disputa en el ambiente académico acerca de cuál sería la localización correcta. Un grupo de Japón coordinado por Katsuhiko Mikoshiba abogaba por la teoría de que se encontraba en el retículo endoplasmático, en tanto que Docampo sostenía que estaba en el acidocalcisoma, y logramos confirmarlo”, dijo Lander.
Despliegues
Según la investigadora de la Unicamp, aparte de ponerle fin a un antiguo embate, este descubrimiento tiene otras diversas implicaciones, ya que facilita la comprensión de los procesos de señalización celular mediados por el calcio en el parásito.
“La señalización por calcio resulta importante para la supervivencia del parásito e interfiere en su potencial de infectar al huésped. Las señales de calcio han sido descritas como importantes para el proceso de invasión celular”, explicó Lander.
Actualmente, el grupo utiliza el sistema CRISPR-Cas9 para estudiar la función de las proteínas TcMCU y TcIP3R, a los efectos de confirmar si la vía de señalización por calcio puede emplearse como blanco terapéutico en el T. cruzi.
“Lo que hacemos básicamente consiste en bloquear o nocautear al gen que codifica a la proteína o inducir su sobreexpresión. Luego efectuamos la caracterización fenotípica de esos linajes mutantes”, explicó.
Parte de los experimentos del Proyecto Temático se está llevando a cabo en el marco de los posdoctorados de Lander y de Miguel Angel Chiurillo Siervo, ambos becarios de la FAPESP.
“Al estudiar la función de diversas proteínas implicadas en la señalización por calcio, nuestro objetivo consiste en identificar una enzima o una ruta metabólica que resulte esencial para el parásito y, al mismo tiempo, que no se encuentre presente en humanos. Así podremos validarla como blanco terapéutico”, dijo Lander.
