El cáncer de pulmón continúa siendo la primera causa de muerte por cáncer en el mundo. La mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña (CPCNP) debutan con enfermedad avanzada y tienen un pronóstico extremadamente pobre. Aunque durante años el abordaje de esta enfermedad se ha basado en el tratamiento sistémico con quimioterapia, la caracterización completa del genoma tumoral ha permitido identificar drivers oncogénicos que han facilitado el desarrollo de terapias dirigidas con resultados muy superiores al los del tratamiento habitual con quimioterapia. En torno al 5% -7% de los pacientes con CPCNP tienen tumores que dependen de oncogenes de fusión que implican a anaplastic lymphoma kinase (ALK), ROS proto-oncogene 1 (ROS1) y RET proto-oncogene (RET) (Soda et al., 2007; Takeuchi et al., 2012) y son sensibles a fármacos dirigidos. La detección de estos genes de fusión, generalmente identificada por las técnicas estándar de hibridación in situ fluorescente (FISH) o inmunohistoquímica (IHQ), es muy importante para guiar las decisiones de tratamiento específico.
En la práctica clínica, las muestras de tejido parafinadas (FFPE) de CPCNP avanzado se utilizan para la detección de las tres alteraciones genéticas más comunes en esta patología: las mutaciones en el gen epidermal growth factor receptor (EGFR), mutaciones en KRAS proto-oncogene, GTPase (KRAS) y reordenamientos de ALK, mientras que la de otros oncogenes de relevancia como ROS1 y RET se analizan más excepcionalmente. Una de las principales limitaciones en el proceso de caracterización genética del CPCNP es la escasez de tejido obtenido de las biopsias pulmonares, por lo que la evaluación multiplex en lugar de una secuencial de cada uno de los oncogenes permitiría la optimización del material. Además, los test habituales de FISH e IHQ están sujetos a un mayor grado de subjetividad por parte del evaluador.
La plataforma nCounter permite realizar test multiplexados de transcritos de fusión (ARNm) mediante perfiles digitales directos o tecnología counting. Esta tecnología utiliza sondas de 50 nucleotidos y, en contraste con las nuevas plataformas de secuenciación (next generation sequencing, NGS), se basa en la hibridación directa sin síntesis de ADN complementario o amplificación por PCR. En este estudio hemos validado esta plataforma en el entorno clínico, demostrando que permite la detección eficaz de los genes de fusión ALK, ROS1 y RET a partir de muestras de tejido parafinado e identifica un mayor número de casos positivos que podrían beneficiarse de las terapias dirigidas (Reguart et al., 2017). Para ello, nuestro grupo analizó, mediante tecnología nCounter, el ARN extraído de muestras FFPE de una cohorte retrospectiva de 108 pacientes con CPCNP avanzado. Los resultados se compararon con los obtenidos mediante técnicas habituales (FISH e IHQ) y se recogió información clínica de un subgrupo de pacientes. La cohorte analizada estaba enriquecida con pacientes positivos para ALK y ROS1 detectados por FISH o IHQ, así como con muestras EGFR-KRAS wild type (WT).
Nuestro trabajo (Reguart et al., 2017) demuestra que la plataforma nCounter necesita una cantidad reducida de material genético para conseguir un análisis óptimo. En concreto, para laminillas de FFPE basta un grosor de 4 mm con un área tumoral de de 1.1 mm2 y un 10% de contenido tumoral para obtener resultados satisfactorios. Respecto a la cantidad de ARN, con 25-200 nanogramos son suficientes.
En el conjunto final de muestras evaluables por nCounter (n=98), se identificaron un total de 55 con transcriptos de fusión: 32 para ALK, 21 para ROS1 y dos para RET. La positividad para ALK, ROS1 y RET en nuestra población de pacientes fue mutuamente excluyente con otros drivers oncogénicos. nCounter mostró una excelente concordancia con la IHQ de ALK (98.5%, CI 91.8 -99.7, Cohen k 0.97) y una concordancia sustancial con el FISH de ALK (87.5%, CI 79.0 -92.9, Cohen k 0.71). Cabe destacar que, en nuestro estudio, nCounter permitió identificar 10 casos positivos para genes de fusión que fueron calificados como negativos por FISH. A este respecto, existe evidencia que las nuevas plataformas moleculares con técnicas NGS son más sensibles que el FISH en la detección de reordenamientos de ALK (Ali et al., 2016).
En el caso de las fusiones de ROS1, se obtuvo un 86% (CI = 76.5-91.9, Cohen k 0.63) y un 87% (CI = 78.0-92.9, Cohen k 0.7) de concordancia entre nCounter vs. IHQ y FISH respectivamente, con un número significativo de muestras positivas sólo para una o dos técnicas. En nuestro estudio, de 21 pacientes ROS1 positivos por nCounter, dos (10%) fueron negativos por FISH y siete (33%) por IHQ. Tomados en conjunto, a diferencia de ALK, nuestros resultados no apoyan el uso de IHQ como la técnica estándar para determinar las fusiones de ROS1.
La evaluación de múltiples oncogenes de forma simultánea, en lugar de secuencial permitiría la optimización del material obtenido en biopsias pulmonares.
En nuestro trabajo pudimos recopilar información retrospectiva de la respuesta clínica a terapia dirigida en 29 pacientes. De los 25 pacientes que obtuvieron beneficio clínico (respuesta parcial o enfermedad estable durante más de 6 meses), 24 eran positivos por nCounter mientras que sólo 22 por FISH. Todos los pacientes que se beneficiaron del tratamiento dirigido con un inhibidor de ALK (n=18) eran nCounter positivos, mientras que tres resultaron negativos o no evaluables por la técnica estándar de FISH. De uno de los pacientes FISH negativo y nCounter-positivo se disponía de un seguimiento clínico completo, el paciente tuvo una buena respuesta a crizotinib durante más de tres años. Estos resultados, junto con los casos recientes publicados de pacientes con CPCNP ALK-FISH negativos/IHQ positivos con respuesta a inhibidores de ALK (Marchetti et al., 2016, Rosoux et al., 2016) cuestionan el FISH como técnica de elección e ilustran la importancia clínica de identificar la expresión del gen de ALK en lugar de la alteración cromosómica, que es una de las ventajas de la tecnología nCounter basada en transcritos.
Asimismo, se disponía de datos de respuesta de nueve pacientes identificados como ROS1 positivos y tratados con crizotinib. Los siete pacientes que obtuvieron beneficio clínico eran FISH positivos y seis también eran positivos por nCounter. El reexamen de la muestra restante reveló una infiltración tumoral muy baja (5%). Los dos pacientes que no obtuvieron beneficio clínico a crizotinib eran positivos por FISH, mientras que uno de ellos era negativo por nCounter.
Nuestros resultados demuestran que nCounter puede resultar más útil que otras tecnologías de NGS en pacientes con CPCNP avanzado ya que, a diferencia de éstas, permite el análisis de múltiples drivers moleculares, a partir de muestras pequeñas de tejido parafinado y con requerimientos mínimos de material genético. En resumen, nuestro trabajo allana el camino para la implementación de la tecnología nCounter a nivel asistencial para el cribado de genes de fusión de ALK, ROS1 y RET.
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Fuente: http://revistageneticamedica.com/2017/02/02/ncounter-cancer-pulmon/
